Abstract
Bakgrunn: Etter en organtransplantasjon benyttes kombinasjoner av immunsuppressive legemidler for å forebygge eventuelle avstøtningsreaksjoner. Transplanterte pasienter har svekket immunforsvar og eksponering for bakterier og virus kan forårsake livstruende infeksjoner. For lav dosering av immundempende legemidler gir økt risiko for avstøtning. Interferon gamma (IFN-γ) er et cytokin (en type protein) som produseres og skilles ut i respons til antigener. Dette cytokinet er med på å stimulere immunsystemet, blant annet ved å aktivere makrofager. Hensikt: Transplantasjon er et felt hvor det fortsatt ligger potensiell stor forskningsdrevet utvikling. Formålet med masteroppgaven var å etablere en analysemetode til måling av den biomolekylære markøren IFN-γ i plasma fra nyretransplanterte pasienter. Videre skulle analysemetoden anvendes i en pilotstudie for å undersøke sammenhenger mellom nivå av IFN-γ og terapeutisk effekt og bivirkninger av immundempende legemidler som brukes for å hindre avstøtning av transplanterte organer. Slike biomarkører kan potensielt brukes til å individualisere legemiddelbehandlingen hos transplanterte pasienter. Materiale og Metode: En metode basert på prinsippet enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ble prøvd ut som målemetode for IFN-γ. Det ble forsøkt å optimalisere betingelsene for denne ELISA-metoden, og metodens ytelse ble vurdert med vekt på nedre målegrense, presisjon og avvik fra teoretiske verdier. Bio-Plex metoden basert på Luminex®-prinsippet ble brukt til å måle IFN-γ i en pilotstudie hos nyretransplanterte. I denne sammenheng ble det tatt prøver av nyretransplanterte pasienter som brukte takrolimus, mykofenolat og prednisolon som immundempende legemidler. IFN-γ ble målt i plasma ett år etter transplantasjon. Resultatene ble tolket sammen med kliniske data. Resultat: Ulike betingelser ble utprøvd for optimalisering av ELISA-metoden. Optimal inkuberingstid mellom tilsetning av substrat og avlesning kom på mellom 15-20 minutter som hadde minste bakgrunnsabsorbans. Ved bruk av lengre inkuberingstider fra en til to timer (etter tilsetning av antistoffdeteksjon og INF-γ) ble metodens presisjon forbedret. Resultat ved undersøkelse av metoden med inkubering uten risting, indikerte at risting gir bedre presisjon enn ikke-risting, mens nøyaktigheten er tilsynelatende lik ved de to metodevariantene. Generelt var avvik fra teoretisk konsentrasjon størst ved de laveste konsentrasjoner av IFN-γ ved alle betingelser. I pilotstudien ble det påvist subklinisk avstøtning ved biopsi ett år etter transplantasjon (post-Tx) hos fire av de 26 pasientene. IFN-γ var 18,6 pg/ml hos kun en av dem mens tre av dem med subkliniske avstøtning ikke hadde målbar IFN-γ konsentrasjon. Hos pasienter uten subklinisk avstøtning var nivå av IFN-γ mellom 4,1 og 30,6 pg/ml hos fem og ikke målbar hos 16 pasienter. Konklusjon: Lengre inkuberingstider (2 timer) medførte bedre presisjon enn en time inkuberingstid ved bruk av ELISA-metoden. Det ble også observert at risting ga bedre presisjon enn ikke-risting. ELISA-metoden ble vurdert til å ha for dårlig sensitivitet og nøyaktighet på lave nivåer. En metode basert på Luminex-prinsippet ble vurdert til å være bedre egnet for måling av INF-γ hos nyretransplanterte. Ett år etter transplantasjon hadde de nyretransplanterte pasientene så lave nivåer av IFN-γ i blodet at det var vanskelig å detektere. Nivåene av IFN-γ var under nedre målegrense hos de fleste. Dette tyder på at de anvendte analysemetodene generelt ikke var sensitive nok til å detektere IFN-γ i denne immunsupprimerte pasientpopulasjonen. Fire av 26 pasienter hadde biopsiverifisert subklinisk avstøtning ett år etter transplantasjon. Det ble ikke observert noen sammenheng mellom subklinisk avstøtning og IFN-γ i plasma. Metoden ser dermed ikke ut til å kunne forutsi avstøtning av transplantert organ. Dette var en studie i en forholdsvis liten pasientpopulasjon. Studier med større pasientgrupper, som også involverer målinger før transplantasjon, bør gjennomføres for å trekke sikrere slutninger om denne problemstillingen.