Abstract
T-cellespesifikt adapterprotein (TSAd), kodet av SH2D2A genet, blir uttrykt i aktiverte T-celler, NK-celler og i endotelceller. TSAd består hovedsakelig av et SH2-domene og et prolinrikt område og inneholder 10 tyrosiner som potensielt kan fosforyleres. Funksjonen til TSAd er enda ukjent, men det har noen kjente bindingspartnere, bl.a. Lck. Lck har en rolle i aktivering av T-cellen og tidligere forskning har vist at TSAd inhiberer aktiviteten til Lck. Det er i flere studier funnet en sammenheng mellom TSAd og utvikling av autoimmune sykdommer. Det er derfor mulig at TSAd spiller en rolle i etablering av immunologisk toleranse som skal hindre utvikling av autoimmune sykdommer.
TSAds SH2-domene er viktig for TSAds funksjon, da det er ett av få steder på TSAd som kan interagere med andre proteiner. TSAds SH2-domene er derfor en viktig nøkkel til å forstå TSAds funksjon. Ved å finne ligander for TSAds SH2-domene, og å bestemme strukturen til dette domenet, kan en få nye holdepunkter for hvilken rolle TSAd spiller i cellene. Human GST-TSAd SH2 fusjonsprotein har vist seg å være vanskelig å uttrykke i E. coli. Målet med denne oppgaven var derfor å undersøke om mus og rotte GST-TSAd SH2 ble bedre uttrykt. Det var også et mål å lage mutanter av human TSAd SH2 og bruke disse som kontroller i initial karakterisering av nye bindingspartnere i T-celler.
I denne oppgaven ble det forsøkt å optimalisere utrykket av GST-TSAd SH2 ved å endre parametere som IPTG-konsentrasjon, temperatur og tid for ekspresjon av GST-TSAd SH2. Ekspresjon ved 15 °C ga ca 25 % mer protein enn ved 20 °C, endring av de andre parameterne ga liten forskjell. GST-TSAd SH2 ble funnet å interagere med Lck i pulldown-forsøk. Tilsvarende forsøk i lysat fra SDF-1 stimulerte Jurkat E6.1 celler viste at GST-TSAd SH2 interagerer med proteiner med størrelse ~18 kDa, og ~60 kDa. Mutanter av GST-TSAd SH2, der den konserverte argininresiduen, R120, ble mutert til alanin eller leusin bandt ikke ~18 kDa og ~60 kDa båndet, men mutantene (R120A/L) bandt Lck.